IF36.1｜单步20倍膨胀显微术实现纳米级成像

20ExM以单次膨胀达到迭代方案的分辨率，简化了超分辨成像流程。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

膨胀显微术（ExM）通过在生物样本中形成可膨胀的水凝胶网络，将生物分子锚定在聚合物上，经化学软化和吸水膨胀后，实现各向同性的物理放大，从而在常规显微镜上获得纳米级分辨率。此前ExM方法要么单次膨胀倍数有限（约4–10倍线性），要么通过二次包埋和迭代膨胀达到更高倍数（约15–20倍线性），但步骤繁琐。迭代膨胀方案（如iExM、ExR）已成功揭示微管中空结构、突触纳米柱等精细结构，但需要多轮凝胶化和处理。

科学问题

卡在哪里： 现有单次膨胀方案无法达到迭代膨胀的高分辨率，而迭代方案步骤多、耗时长，限制了其在常规生物学实验中的广泛应用。

本文要回答： 开发一种单次膨胀即可达到约20倍线性膨胀、分辨率<20 nm的ExM方案，并验证其在细胞和组织中的应用。

技术路线

作者主要用了：优化DMAA/SA水凝胶配方、氮气保护凝胶化、膨胀后免疫染色、共聚焦成像、FRC分辨率分析。

作者从X10方案出发，通过提高SA:DMAA比例和单体浓度来追求更高膨胀倍数，但发现批次间差异大，归因于氧浓度影响自由基聚合。通过在氮气手套袋中凝胶化并优化引发剂浓度和凝胶时间，实现了稳定的高膨胀倍数。随后在细胞培养和脑组织上验证分辨率，并用膨胀后染色揭示突触纳米结构。

图 1　Fig. 1。图1展示20ExM工作流程，与X10HT方案相比，关键差异用绿色标注：提高SA:DMAA比例、在氮气手套袋中凝胶化、调整引发剂浓度和凝胶时间。图中显示细胞和组织样本经AX处理锚定蛋白，单体渗透后凝胶化，再经软化、膨胀和染色，最终实现约20倍线性膨胀。

核心亮点

亮点 1｜高膨胀水凝胶的稳定制备

通过调整SA:DMAA摩尔比至2:3、单体与水质比至3:2，并在氮气手套袋中凝胶化，解决了批次间差异问题。优化引发剂浓度（细胞7.7 µM，组织1.6 µM）和凝胶时间（细胞2小时，组织16–20小时），细胞培养膨胀倍数达21.50±1.70，脑组织达18.44±0.33，且各向同性。

图 2　Fig. 2。图2a–c显示HEK293细胞微管染色，20ExM后可见中空结构，侧壁峰间距62.1±8.8 nm，与iExM相当。图2d–f显示微管横截面呈环状。图2g,h为脑片膨胀前后畸变分析，r.m.s.误差低。图2i,j为FRC分辨率分析，有效分辨率17.9±1.3 nm。

亮点 2｜微管中空结构验证分辨率

在HEK293细胞中预膨胀染色微管，20ExM后观察到中空结构，侧壁峰间距62.1±8.8 nm，与iExM的58.7±10.3 nm无显著差异。FRC分析显示有效分辨率17.9±1.3 nm，与迭代膨胀方案相当。沿微管长轴的畸变估计为8.8 nm，与iExM的10.3 nm相当。

图 3　Fig. 3。图3a为DAPI染色的脑片，显示体感皮层分层。图3b为膨胀后RIM1/2和PSD95染色，显示突触前、后支架并置。图3c,d自相关分析显示纳米域大小约50–70 nm。图3e,f蛋白富集分析显示两种蛋白在20–25 nm内对齐。

亮点 3｜突触纳米柱的揭示

对小鼠体感皮层2/3层脑片进行20ExM后膨胀染色RIM1/2和PSD95，观察到突触前、后支架蛋白的并置。自相关分析显示两种蛋白形成约50–70 nm的纳米域，蛋白富集分析表明两者在距峰值20–25 nm处信号平坦，表明精确对齐，与STORM和ExR结果一致。

亮点 4｜核孔复合物与线粒体成像

在NUP96::mNeonGreen细胞中，20ExM清晰分辨核孔环结构，半径55.4±8.9 nm，与冷冻电镜结构一致；相邻角间距48.6±12.8 nm，与预期42 nm相符。线粒体外膜TOM20染色显示中空结构，与STORM图像一致。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： 优化DMAA/SA水凝胶配方、氮气保护凝胶化、膨胀后免疫染色、共聚焦成像、FRC分辨率分析
• 公开数据： 原文未给出公开组学登录号
• 代码： 公开仓库 http://github.com/shiwei-w/20ExM、https://github.com/shiwei-w/20ExM；本地已克隆：20ExM
• 谁该点开原文： 从事超分辨成像、神经科学、细胞生物学的研究人员。

带走一句

20ExM将迭代膨胀的分辨率带入单步流程，简化了超分辨成像，适合常规实验室采用。