IF36.1｜BACS实现全转录组假尿苷绝对定量与单碱基测序

新化学方法BACS让假尿苷检测从模糊走向精准，全面改写人类转录组Ψ图谱。

这篇按生信解读号的读法拆：先看背景和问题，再看作者怎么做、做出了哪几条硬发现，最后把数据和代码收走。

研究背景

假尿苷（Ψ）是细胞RNA中最丰富的修饰之一，广泛存在于rRNA、snRNA、tRNA等非编码RNA以及mRNA中，参与剪接、翻译、RNA稳定性及RNA-蛋白互作等关键过程。在真核生物中，Ψ由假尿苷合酶（PUS）催化形成，且与多种疾病（包括癌症）相关。然而，Ψ的功能研究长期受限于检测技术的灵敏度和准确性。传统CMC化学法标记效率低且缺乏化学计量信息；近期发展的亚硫酸氢盐（BS）测序法（如BID-seq、PRAISE）虽能定量，但依赖缺失信号，无法精确定位连续尿苷或密集Ψ位点。因此，开发一种高分辨率、高准确度的Ψ检测方法成为领域迫切需求。

科学问题

卡在哪里： 现有CMC法背景噪音高，无法区分真实Ψ信号；BS法产生缺失而非突变，导致连续U序列中Ψ位置模糊、密集Ψ区域检测困难，且定量准确性差。此外，人类snoRNA、tRNA及mRNA的Ψ图谱仍不完整，PUS酶的靶标和序列基序也存在争议。

本文要回答： 本文旨在开发一种基于新化学原理的Ψ测序方法BACS，实现单碱基分辨率和绝对定量，并利用该方法全面解析人类转录组Ψ图谱，阐明关键PUS酶的靶标与基序，并探究病毒RNA中的Ψ修饰。

技术路线

作者主要用了：BACS化学标记、高通量测序、CRISPR敲除、质谱验证、生物信息学分析。

作者设计2-溴丙烯酰胺与Ψ的N1发生迈克尔加成，进而诱导分子内O2-烷基化环化，形成nce1,2Ψ加合物，在逆转录时产生U-to-C突变信号（图1a）。通过MALDI和UHPLC-MS/MS验证反应产物，并在合成RNA上确认高转化率（87.6%）和低假阳性率（0.75%）。随后，将BACS应用于HeLa等细胞系的rRNA、snRNA、snoRNA、tRNA和mRNA，系统评估其性能，并与CMC法和BS法进行比较。进一步利用CRISPR敲除TRUB1、PUS7和PUS1，解析PUS依赖的Ψ位点。最后，将BACS应用于多种RNA病毒和EBV感染的细胞，检测病毒RNA中的Ψ。

图 1　Fig. 1。图1展示BACS化学原理与性能验证。a示意2-溴丙烯酰胺与Ψ反应形成环化加合物；b MALDI证实10mer RNA上69 Da质量增加；c显示在256种NNΨNN基序中转化率中位数87.6%，假阳性率0.75%；d为NNUNN基序的校准曲线，R²=1.00，证明BACS可准确定量Ψ化学计量。

核心亮点

亮点 1｜BACS突破连续U与密集Ψ检测瓶颈

BACS通过诱导Ψ-to-C突变而非缺失信号，成功解析了18S rRNA中Ψ801/Ψ814/Ψ815等连续尿苷位点，以及28S rRNA中Ψ3737/Ψ3741/Ψ3743/Ψ3747/Ψ3749等极端密集区域。与BID-seq和PRAISE相比，BACS在连续U序列中定位准确，且定量结果与质谱数据相关性更高（r=0.90 vs 0.37和0.48）。在合成spike-in上，BACS转化率高达87.6%，假阳性率仅0.75%，且线性校准曲线R²=1.00，证明其绝对定量能力。

图 2　Fig. 2。图2展示BACS在rRNA和snRNA中的应用。b列出HeLa胞质和线粒体rRNA中检测到的Ψ位点数；c-e显示28S、18S、5.8S rRNA中BACS转化率远高于对照；f维恩图显示BACS与SILNAS MS在胞质rRNA中重叠103/105个位点；g-h展示snRNA中Ψ位点数及与MS的重叠；i突出U2 snRNA全部14个Ψ位点被BACS成功检测。

亮点 2｜全面绘制人类ncRNA Ψ图谱

BACS在HeLa细胞rRNA中检测到所有已知Ψ位点（105个中的103个），并发现新位点Ψ4938（28S rRNA）。在剪接体snRNA中，BACS首次通过高通量测序完整鉴定出U2 snRNA的全部14个Ψ位点，并确认U4atac snRNA中存在连续Ψ11/Ψ12。在snoRNA中，BACS检测到304个Ψ位点，远超Ψ-seq（11个）和BID-seq（39个），且Ψ在box C/D和H/ACA snoRNA的功能区域富集。在tRNA中，BACS获得609个胞质tRNA Ψ位点和54个线粒体tRNA Ψ位点，揭示了位置55和13的高修饰水平。

图 3　Fig. 3。图3展示人类tRNA的Ψ图谱。a显示每种胞质和线粒体tRNA同型中检测到的Ψ位点中位数；b热图展示胞质tRNA高置信Ψ位点的修饰水平，位置13、27-28、38-40和55突出；c箱线图比较选定位置的修饰水平，显示位置55修饰水平最高且变异小；d维恩图显示BACS与已发表数据在线粒体tRNA中的重叠。

亮点 3｜mRNA Ψ修饰低丰度且具序列偏好

在HeLa poly-A+ RNA中，BACS鉴定出1,335个Ψ位点，其中大部分修饰水平低于20%，仅少数高于50%。Ψ主要富集于CDS和3′UTR，且55.3%位于连续尿苷序列中。基序分析显示Ψ偏好USΨAG和GUΨCN，分别对应PUS7和TRUB1的识别基序。密码子偏好分析表明Ψ富集于UUY、UUG、AUU和GUU等含连续U的密码子。同时，BACS还能同时检测A-to-I编辑位点（1,121个）和m1A，展示了多修饰并行检测能力。

图 4　Fig. 4。图4展示HeLa mRNA中Ψ和A-to-I编辑的分布。a显示不同修饰水平区间的位点数；b为修饰水平分布直方图，Ψ多为低修饰，A-to-I编辑平均20%；c显示Ψ和A-to-I在mRNA和ncRNA特征中的分布；d元基因谱显示Ψ富集于CDS和3′UTR，A-to-I富集于3′UTR；e维恩图显示携带Ψ和A-to-I的转录本几乎不重叠；f-g展示Ψ基序频率和修饰水平，GUΨCN基序修饰水平较高。

亮点 4｜PUS敲除揭示新靶标与扩展基序

TRUB1敲除未完全消除胞质tRNA Ψ55，提示存在冗余PUS；但线粒体tRNA Ψ55完全消失，挑战了TRUB2唯一负责的观点。TRUB1基序从GUΨCNA扩展为GUΨNNA。PUS7敲除显示其新靶标包括胞质tRNA Ψ20B、Ψ36、Ψ50和线粒体tRNAMet Ψ50，且基序扩展为UNΨAR和UGΨKG。PUS1敲除证实其负责胞质tRNA Ψ27/28和线粒体tRNA Ψ27/28及Ψ66/67/68，并催化所有7个线粒体mRNA Ψ位点，表明PUS1是线粒体主要PUS。

图 5　Fig. 5。图5展示PUS敲除对Ψ谱的影响。a整合视图显示TRUB1、PUS7和PUS1依赖的tRNA Ψ位点；b箱线图显示TRUB1敲除后胞质tRNA Ψ55部分保留，线粒体tRNA Ψ55完全消失；c散点图展示全转录组TRUB1依赖位点；d序列基序显示TRUB1识别GUΨNNA；e-h分别展示PUS7和PUS1在胞质和线粒体tRNA中的靶标；i显示PUS1催化所有线粒体mRNA Ψ位点。

亮点 5｜病毒RNA中Ψ修饰的重新评估

BACS在SARS-CoV-2、HCV、ZIKV、HDV和SINV五种RNA病毒中均未检测到高置信度Ψ位点，尽管病毒RNA丰度和测序深度足够。在EBV编码的EBER2中，BACS发现一个高修饰的Ψ114位点（而非之前报道的低修饰Ψ160），且该位点在不同EBV株和宿主细胞中保守。EBER1中未检测到Ψ。这些结果提示不同病毒家族对Ψ的利用存在差异，并强调了高特异性方法的重要性。

生信可带走

这一块是给做分析的人用的，不是科普点缀。

• 方法栈： BACS化学标记、高通量测序、CRISPR敲除、质谱验证、生物信息学分析
• 公开数据： GSE179798、GSE241849
• 代码： 公开仓库 https://github.com/lkong888/bacs、https://github.com/y9c/cpup；本地已克隆：cpup、bacs
• 谁该点开原文： 从事RNA修饰、表观转录组、PUS酶功能或病毒RNA生物学研究的科研人员。

带走一句

BACS用突变信号替代缺失信号，解决了连续U和密集Ψ的定位难题，为RNA修饰分析提供了新标准。做修饰组学的团队应关注其定量准确性和多修饰并行检测能力。